Aktiivtsenter on ensüümi pinnaala, millega seostub substraat. Aktiivtsentris paiknevad aminohappejääkide katalüütilised rühmad, mis seovad endaga substraadi. Aktiivtsentril on kaks põhilist rolli:
Akriivtsenter ja substraat peavad olema komplementaarsed, et saaks tekkida ES kompleks. Ensüüm võib muuta ka oma konformatsiooni, et siduda substraati efektiivsemalt. Substraati ja ensüümi hoiavad koos nõrgad vastastiktoimed: vesiniksidemed, hüdrofoobsed interaktsioonid ja hüdrofiilsed interaktsioonid. Harva esinevad ka kovalentsed ja kooperatiivsed sidemed.
Kui substraat on muundatud produktiks, eemaldub see ensüümi aktiivtsentrist, sest kaob ensüümi ja tekkinud produkti komplementaarsus.