Cas9 | ||
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CRISPR-associated protein Cas9 von Streptococcus pyogenes | ||
Andere Namen |
SpyCas9, Cas5, Csn1, Csx12 | |
Masse/Länge Primärstruktur | 1.368 Aminosäuren, 158.441 Da | |
Bezeichner | ||
Externe IDs | ||
Enzymklassifikation | ||
EC, Kategorie | 3.1.-.- | |
Vorkommen | ||
Homologie-Familie | Hovergen |
Cas9 (von englisch CRISPR-associated, veraltet auch Cas5, Csn1 oder Csx12) ist eine Endonuklease und ein Ribonukleoprotein aus Bakterien.
Das CRISPR/Cas-System entstammt einem adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus aus Bakterien, dem CRISPR.[1][2] Die Endonuklease Cas9 kann eine bestimmte RNA-Sequenz (crRNA repeat, Sequenz GUUUUAGAGCU(A/G)UG(C/U)UGUUUUG)[3] binden und DNA schneiden. Diese crRNA repeat-Sequenz bildet eine RNA-Sekundärstruktur, bindet eine tracrRNA und wird dann von Cas9 gebunden.[4] An der crRNA repeat-Sequenz befindet sich anschließend eine an die Ziel-DNA bindende Sequenz (crRNA spacer), beide Sequenzen werden zusammen als crRNA bezeichnet. Als zweiter Teil dient die crRNA spacer-Sequenz in der Funktion eines variablen Adapters, welche komplementär zur Ziel-DNA ist und an die Ziel-DNA bindet. Dadurch wird die DNA nahe der Bindungsstelle geschnitten. Zur Hemmung von Cas-Proteinen werden von Bakteriophagen Anti-CRISPR-Proteine gebildet.
Cas9 besteht aus zwei Bereichen, mit der RNA eingebettet zwischen dem α-helikalen Bereich (blau) und dem Bereich der Endonuklease (cyan, orange, grau). Die beiden Bereiche sind über eine Helix verbunden. Der Nukleasebereich enthält zwei Endonuklease-Proteindomänen, RuvC (grau) und die HNH-Nuclease (cyan). Die HNH-Nuklease schneidet den an die crRNA gebundenen DNA-Strang, während die RuvC den gegenüberliegenden Strang schneidet. Die zu schneidende DNA muss das Protospacer adjacent Motif (PAM) enthalten, das aus den drei Nukleotiden NGG besteht, und von der PAM-interacting domain am C-Terminus von Cas9 (PI-Domäne, orange) gebunden wird. Cas9 besitzt drei verschiedene Konformationen, ungebunden, an RNA gebunden und an RNA und DNA gebunden.
Cas9 bindet die stem-loop-Sekundärstruktur der crRNA.[5] Der Komplex aus Cas9, crRNA und tracrRNA bindet an die Ziel-DNA und schneidet beide DNA-Stränge.[6] Die beiden RNA können auch in einem einzigen, abschnittsweise selbsthybridisierenden Strang untergebracht werden (single-guide RNA, sgRNA).[7] Die DNA-Bindungsdomäne (recognition domain, REC) die Endonukleasedomäne (NUC) sind räumlich getrennt. Da die HNH-Domäne flexibel mit dem restlichen Protein verbunden ist, ist sie im Cas9-Proteinkristall nicht erkennbar. Cas9 verwendet Manganionen als Cofaktoren.[8]
Es existieren mehr als 40 verschiedene Cas-Proteinfamilien.[9] Die Familien können in drei Typen eingeteilt werden.[10] Typ I, II und IIIa binden und schneiden doppelsträngige DNA, während Typ IIIb einzelsträngige RNA bindet und schneidet.[11][10] Bei allen Typen erfolgt die Bildung des spacers in Bakterien durch Cas1 und Cas2.[11] Bei den Typen I-A und I-E erfolgt der DNA-Schnitt durch Cas3, während bei Typ II Cas9, bei Typ III-A Csm6 und bei Typ III-B Cmr4 den Schnitt bewirkt.[11] Die Typen I und III sind strukturell verwandt, was einen gemeinsamen Ursprung nahelegt.[10] Das helikale Protein Cas des Typs III besitzt mehrere β-hairpins, die in Abständen von sechs Nukleotiden die Doppelhelix der crRNA und der Ziel-RNA für den Schnitt auseinanderdrücken.[10]
Cas9 wird als Bestandteil des CRISPR/Cas-Systems zum Genome Editing verwendet.